立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Rickettsia spp. Probe qPCR Kit

立克次氏體（Rickettsia）為革蘭氏陰性菌，是一類專性寄生于真核細(xì)胞內(nèi)的 G原核生物。是介于細(xì)菌與病毒之間，而接近于細(xì)菌的一類原核生物。一般呈球狀或桿狀,是專性細(xì)胞內(nèi)寄生物，主要寄生于節(jié)肢動(dòng)物，有的會(huì)通過蚤、虱、蜱、螨傳入人體、如斑疹傷寒、戰(zhàn)壕熱。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)立克次氏體的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)立克次氏體通用高度保守區(qū)設(shè)計(jì)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋PCR 陽性對(duì)照（以10E1-10E6 拷貝/μL 這6個(gè)10倍稀釋度為例）

如果做定性實(shí)驗(yàn)，則此步可以跳過。如果做定量實(shí)驗(yàn)，則需要稀釋陽性對(duì)照做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產(chǎn)品只提供 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

1.  標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.         用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.         在 6 號(hào)管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.         換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.         換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.         重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上用。

二、樣品 DNA 的制備

7.         如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是樣品制備 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是樣品制備 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?span> 10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。

8.         用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。

二、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.         如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9個(gè)PCR 管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第4號(hào)管中的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，

在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè) 置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣

10.         品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

四、數(shù)據(jù)處理

12.         如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

     13.    如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。